Willem Witsen groeide op aan de Prinsengracht en het Westeinde in Amsterdam. Van 1876 tot 1884 nam hij in die stad tekenlessen aan de Rijksakademie van Beeldende Kunsten. Daar raakte hij bevriend met schilders als Willem Tholen, Jacobus van Looy, Jan Veth, Eduard Karsen en Jan Toorop, en wat later ook met George Breitner en Isaac Israels. Na een verblijf in Londen van 1888-1891, waar hij kennis maakte met het werk van Whistler, begon Witsen met het schilderen van dromerige, verstilde stadsgezichten in een donker coloriet. Deze stadsgezichten, die de stemming en van de tijdloze schoonheid van de stad weergeven, vormen het hoogtepunt uit zijn werk. In tegenstelling tot de drukke stadsimpressies van Breitner en Israels zag Witsen Amsterdam als monument van tijdloze schoonheid. Net als Breitner was Witsen fotograaf, wat zijn speciale manier van kijken verklaart. Na 1910 schilderde hij veel van zijn Amsterdamse stadsgezichten vanaf het water. Hij had bij de Montelbaanstoren een schuit met directiekeet liggen die dienst deed als drijvend atelier. Vanaf 1911 verruilde hij die voor een dekschuit met een keet die hij liet verplaatsen naar plekken waar hij wilde werken.
Witsen werkte tot 1884 vaak op Ewijckshoeve, het familiehuis van de familie bij Lage Vuursche. Daar waren zijn Amsterdamse vrienden, jonge, ambitieuze kunstenaars die zich beschouwden als grote vernieuwers in kunst en literatuur, altijd welkom. Maar het was ook een plek waar Witsen zich kon onttrekken aan de dynamiek van de grote stad en zich ongestoord op de natuur kon richten.
Vanaf april 1887 keerde hij terug naar Amsterdam en gebruikte enkele maanden het atelier van zijn vriend George Breitner aan de Oude Schans 5 te Amsterdam, met uitzicht op de Montelbaanstoren.
In 1893 trouwde Witsen met de dichter en schrijver Betsy van Vloten, die hij had leren kennen bij haar zwager Frederik van Eeden. Ze verhuisden naar Ede, waar ze drie zoons kregen. Het huwelijk werd echter in 1902 ontbonden en vijf jaar later trouwde Witsen met Marie Schorr. Met haar vestigde hij zich weer in Amsterdam aan het Oosterpark 82, het huis waar hij vroeger met Breitner en Isaac Israels een atelier had, maar dat het echtpaar vanaf 1906 in zijn geheel zou bewonen en als het Witsenhuis bekend zou worden. Witsen werd een veelgevraagd portretschilder en begon ook met het schilderen van stillevens. Met zijn vrouw ondernam hij talloze reizen, niet alleen binnen Europa, maar ook overzee, naar San Francisco en Canada en in 1921/1922 Nederlands-Indië. Kort daarna, in 1923 overleed Witsen als gevolg van een luchtweginfectie in het OLVG in Amsterdam.
Witsen was niet alleen schilder en etser, in 1885 richtte hij samen met twee kunstliefhebbers de Nederlandse Etsclub op, maar ook fotograaf. Die interesse was ontstaan tijdens zijn verblijf in Londen vanaf eind 1888. De foto’s die hij maakte gebruikte hij soms ook voor het maken van schilderijen in zijn atelier, wat het lage gezichtspunt en de afgesneden gebouwen verklaart in zijn werk. Ook fotografeerde Witsen vaak zijn kunstenaarsvrienden en familie in allerlei gemoedstoestanden. Op zijn reizen door Europa ging de camera altijd mee en hoewel hij niet geschoold was als fotograaf had hij een heel eigen benadering waarbij sterke licht-donker contrasten voor hem belangrijk waren.